FAQ (Preguntas frecuentes)

¿Cómo debo resuspender mis oligos?

Solventes recomendados:
Los oligos pueden ser resuspendidos en agua estéril libre de nucleasas o preferentemente en buffer TE (10 mM Tri-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) si se requiere guardar la solución de oligo por largos periodos de tiempo.

Concentración:

Para preparar una solución Stock a una concentración de 100µM: multiplica por 10 el número total de nanomoles entregado (lo encontrarás en la etiqueta y certificado de análisis de tu oligo/sonda). El número resultante será el volumen en microlitros de solvente a utilizar para resuspenderlo.
Ejemplo:
Rendimiento final: 23.2 nanomoles
Volumen de solvente necesario para preparar solución Stock: (23.2)X(10)= 232 µl

Resuspension:

Centrífuga brevemente tus viales para asegurar que el pellet del oligo se vaya al fondo.
Utiliza el solvente o solución recomendados.
Permite que el oligo se hidrate por varios minutos a temperatura ambiente, después, vortexea.

Almacenamiento:

Los oligos liofilizados pueden guardarse a -20°C o a temperatura ambiente y son estables por largos periodos de tiempo antes de ser manipulados por primera vez.Es importante resuspender los oligos en buffer TE o agua libre de nucleasas para garantizar la integridad física y evitar la degradación. Los oligos resuspendidos deben ser alicuotados y almacenados a 4°C o a -20°C.Evita procesos de congelar y descongelar la solución de oligos para prevenir degradación.Cuando se trata de sondas, protegerlos de la luz es indispensable para evitar fotoblanqueo (photobleaching).

¿Es lo mismo escala que rendimiento?

A menudo hay confusión en torno a los significados de “escala de síntesis” y “rendimiento de síntesis”. En pocas palabras, la escala se refiere a la cantidad de material inicial utilizado para sintetizar el oligonucleótido. El rendimiento, por otro lado, se refiere a la cantidad de oligo recuperado después de todas las etapas de síntesis y purificación. Ninguna reacción química ni proceso físico es 100% eficiente, así que la cantidad entregable final del oligonucleótido nunca es igual a la cantidad de partida para la síntesis. Factores como el tamaño del oligo, modificaciones, eficiencia de acoplamiento, composición nucleotídica, y procesos de purificación adicionales afectan aún más la cantidad de producto final (rendimiento).

¿En qué casos es aceptable usar oligos desalados estándar?

T4Oligo recomienda utilizar oligos desalados estándar en amplificaciones rutinarias por PCR, qPCR y procesos de secuenciación de ADN. Sin embargo, si sus oligos son mayores de 40 bases en longitud, nosotros le recomendamos realizar una purificación adicional con el propósito de mejorar significativamente la eficiencia de sus oligos.

¿Por qué debo considerar purificar mis oligos?

T4Oligo recomienda purificar cualquier oligo que sea utilizado para aplicaciones sensibles como PCR tiempo real o secuenciación de ADN, ya que como resultado del proceso de purificación se remueven oligos incompletos que se generan normalmente durante el proceso de síntesis. Un proceso de purificación mejora significativamente la eficiencia de los oligos, sobre todo respecto a la especificidad de reconocimiento de su secuencia blanco.

¿Puedo purificar mi oligo sintetizado a una escala de 25 nanomoles?

No, debido a la pérdida de rendimiento durante la purificación, la escala más pequeña permitida es 50 nanomoles en el caso de cartucho y 100 nanomoles para purificación por PAGE ó HPLC.

¿En qué casos se recomienda una purificación por cartucho y en cuales una purificación por HPLC?

T4Oligo recomienda una purificación por cartucho en el caso de oligos cortos y largos que no posean modificaciones, así mismo se recomienda en oligos degenerados de corta longitud (de 10 a 65 bases) utilizados para clonación, retardos y mutagénesis, entre otros.

T4Oligo recomienda la purificación por HPLC en el caso de oligos marcados fluorescentemente ya que, debido a su hidrofobicidad, son purificados de manera más adecuada por éste método. Una purificación por HPLC ayuda a remover subproductos de la síntesis originando oligos y sondas con mayor especificidad. Nosotros ofrecemos purificaciones HPLC en fase reversa (RP-HPLC) en el caso de oligos con marcas fluorescentes y/o alguna otra modificación hidrofóbica.

Si tiene alguna duda o pregunta, no dude en contactarnos en el correo soporte@t4oligo.com, en el cual la persona encargada de la síntesis de su oligo estará para atenderlo.

¿Cuál es el porcentaje de pureza que se obtiene en cada proceso de purificación?

Una purificación por HPLC garantiza una pureza del 85%, mientras que una purificación por electroforesis (PAGE) garantiza el 90%. En el caso de la purificación por cartucho, se garantiza una purificación de alrededor del 90%.

¿Puedo purificar un oligo que contiene bases degeneradas?

Un oligo degenerado es en realidad una colección de primers que varían en una o varias bases llamadas degeneradas. Por ejemplo, un oligo con una degeneración “N” significa que en esa posición puede haber cualquiera de los 4 nucleótidos (ATGC), idealmente en una proporción de 25% cada uno. La utilidad de una degeneración depende directamente de que se conserve la proporción de las variantes, la cual puede alterarse con la purificación. La decisión de purificar un oligo está directamente influenciada por las necesidades de su investigación. Un proceso de purificación eliminará subproductos originados en el proceso de síntesis pero también modificará el radio equimolar de los oligos conteniendo las distintas variantes de nucleótidos. Tomando en cuenta esto, existen algunos casos en los cuales la purificación de un oligo está justificada en mayor medida, por ejemplo, el caso de oligos muy largos o modificados cerca del extremo 3´. Fuera de estos casos es importante considerar no purificar, ya que podría sólo ser un gasto innecesario para su presupuesto.

Si tiene alguna duda sobre cuando purificar un oligo degenerado, no dude en contactarnos en el correo soporte@t4oligo.com, donde le asignaremos un especialista personalizado.

¿En qué casos se recomienda una purificación por cartucho y en cuales una purificación por HPLC?

T4Oligo recomienda una purificación por cartucho en el caso de oligos cortos y largos que no posean modificaciones, así mismo se recomienda en oligos degenerados de corta longitud (de 10 a 65 bases) utilizados para clonación, retardos y mutagénesis, entre otros.

T4Oligo recomienda la purificación por HPLC en el caso de oligos marcados fluorescentemente ya que, debido a su hidrofobicidad, son purificados de manera más adecuada por éste método. Una purificación por HPLC ayuda a remover subproductos de la síntesis originando oligos y sondas con mayor especificidad. Nosotros ofrecemos purificaciones HPLC en fase reversa (RP-HPLC) en el caso de oligos con marcas fluorescentes y/o alguna otra modificación hidrofóbica.

Si tiene alguna duda o pregunta, no dude en contactarnos en el correo soporte@t4oligo.com, en el cual la persona encargada de la síntesis de su oligo estará para atenderlo.

¿Sus sondas son mayores a 30 o menores a 20 bases?

Por favor tome en cuenta que las sonadas con secuencias más grandes de 30 bases probablemente no tendrán tanta eficiencia en el “quenching”, para tales casos sugerimos considere colocar el “quencher” internamente. Así mismo, si utiliza secuencias previamente reportadas y éstas son menores a 20 bases, podrían estar diseñados como sondas Minor Groove Binder y probablemente no podrán adherirse a la temperatura adecuada de 70 °C. Contrario a lo que indican las campañas de marketing, no es necesario invertir fuertes sumas en utilizar sondas que contienen la molécula MGB™, T4Oligo cuenta con alternativas privadas y accesibles con resultados similares o superiores.

¿Que aditivos puedo usar para mejorar la amplificación en mis reacciones de PCR?

Una variedad de aditivos al PCR y algunos agentes potenciadores se han utilizado para aumentar el rendimiento, la especificidad y la consistencia de las reacciones de PCR. Mientras que estos aditivos pueden tener efectos beneficiosos en alguna amplificaciones que es imposible predecir qué agentes serán útiles en un contexto particular y por lo tanto debe ser probado empíricamente para cada combinación de molde y los cebadores. algunos de los más populares de estos aditivos se describen a continuación.

DMSO a 2-10%, puede ser necesaria para la amplificación de algunas plantillas, sin embargo concentraciones mayores al 10% de DMSO pueden reducir la actividad de la Taq polimerasa hasta en un 50%, por lo que no se recomienda para su uso rutinario. El DMSO se cree que reduce la estructura secundaria y es particularmente útil para las plantillas ricas en GC.

Betaína o monohidrato de betaína se utiliza generalmente a una concentración final de 1.0 a 1.7 M.

La formamida se utiliza generalmente en 1-5%,  y 10% de formamida se reporta no tener ningún efecto sobre la actividad de Taq polimerasa.

Detergentes no iónicos, estabilizan Taq polimerasa y también pueden suprimir la formación de la estructura secundaria. 0,1-1% de Triton X-100, Tween 20 o NP-40 pueden aumentar el rendimiento, pero también pueden aumentar la amplificación no específica. La concentración por SDS en el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos hasta 0.01% puede inhibir la PCR mediante la reducción de la actividad Taq polimerasa hasta un mínimo de 10%, sin embargo, la inclusión de 0.5% de Tween 20 o NP-40 neutralizaran eficazmente este efecto.

TMAC se utiliza generalmente a una concentracion final de 15-100 mM para eliminar el cebador no especifico. TMAC también se a utilizado para reducir la potencial disparidad ADN-RNA y mejorar la rigurosidad de las reacciones de hibridación.

El análogo de base 7-deaza-2’desoxiguanosina puede facilitar la amplificación de plantillas con estructuras secundarias estables cuando se utiliza en lugar de dGTP en una proporción de 3:1,7-deaza-2’desoxiguanosina.

BSA ha demostrado ser particularmente útil cuando se intenta amplificar el ADN antiguo o plantillas que contienen inhibidores de la PCR como melanina.

Si tiene alguna duda relacionada no dude en contactarnos al correo soporte@t4oligo.com donde le asignaremos un especialista personalizado.

Ecuador #220 Fracc.Tabachines c.p 36615 Irapuato , Guanajuato, Mexico.

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