Oligo nucleótidos

T4 Oligo le enviará desde 48 horas, sus oligonucleótidos desalados y purificados por filtración en Gel (Purificación DFG), ninguna compañía puede ofrecerle la misma calidad sumada a esos tiempos de entrega y con garantía de resíntesis inmediata en caso de reclamación. La calidad de nuestros oligonucleótidos DFG es controlada por procesos de control estrictos tales como análisis por HPLC y espectrometría de masas.

¡Nuestros oligos son los que le convienen!

  • Información del producto
  • Escalas y precios
  • Información técnica
  • Opciones de purificación
  • Desempeño y calidad

Información del producto

¿Requiere oligonucleótidos con degeneraciones o purificaciones mayores?

No hay problema, T4Oligo puede sintetizar sus primers en escalas de 25nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1000 nM y más, incluyendo degeneraciones y purificaciones especiales. Si requiere mayor información sobre el tipo de purificación que mejor le conviene, favor de dar click aquí (Hipervínculo a Opciones de Purificación) , o bien, solicite le sea asignado un especialista de T4Oligo a soporte@t4oligo.com

 

Cotiza tus oligos aquí

Escalas y precios

T4Oligo le enviará todos sus oligos liofilizados, y con la purificación de su elección ( DFG, RP o HPLC)

Es recomendable que se elijan escalas mayores a 50 nM para oligonucleótidos mayores a 35 bases o con modificaciones tales como degeneraciones, si desea mayor información sobre las opciones de purificación , tipos de modificación , o bien sugerencias de almacenaje y resuspensión por favor vea la información técnica.

Información técnica

Resuspensión y almacenamiento de sus oligos.

Para resuspender o reconstruir sus oligos y sondas agregar el volumen de agua o buffer que indica el certificado de síntesis y seguir los siguientes pasos:

1 centrifugar el tubo para asegurarse que el pellet se encuentra en el fondo del tubo.
2 agregar el volumen apropiado indicado en el certificado de síntesis
3 esperar unos minutos para que se hidrate el pellet y sea más fácil Resuspenderlo
4 colocar el tubo en el vortex por 15 segundos

Se recomienda Re suspender sondas marcadas con Cy® en buffer TE a pH 7

Escala vs. Rendimiento.

Escala
La escala de síntesis se refiere a la materia prima, en este caso el soporte y protocolo estandarizado que se utiliza para la síntesis de oligonucleótidos.

Rendimiento
Corresponde a la cantidad de producto final obtenido, el rendimiento de un oligonucleótido depende de la longitud, secuencia, modificación y purificación.

Purificación vs. Rendimiento

Corresponde a la cantidad de producto final obtenido, el rendimiento de un oligonucleótido depende de la longitud, secuencia, modificación y purificación.
En resumen, la purificación vs pureza puede resumirse de la siguiente manera:

Menor purificación= mayor rendimiento

Mayor purificación= menor rendimiento

HPLC vs PAGE= mayor rendimiento y ligeramente menor pureza

PAGE vs HPLC= ligeramente mayor pureza pero menor rendimiento

Cartucho vs HPLC o PAGE= igual o mayor pureza y rendimiento, pero limitado a ciertos oligos.

 

Contrario a lo que se piensa, la pureza de un oligo no se refiere primordialmente a la presencia de otros compuestos diferentes a ácidos nucleicos en el oligo “final”, sino a la cantidad de oligo “útil” o completo que se entrega al cliente; es decir, durante la síntesis se genera una pequeña proporción de oligos truncos o con ramificaciones, lo cual es normal dentro de cierto rango, pero esas secuencias truncas deben ser mínimas o casi nulas cuando el oligo llega a su laboratorio. Para los estándares de calidad de T4Oligo si el 99.1 % los oligos no están completos en su secuencia, entonces se desecha el producto por considerarse de mala calidad, nuestro estándar es 10 veces más estricto que el de nuestro competidor más cercano de acuerdo a estudios comparativos realizados en nuestro laboratorio.

El producir oligos completos depende tanto de una síntesis eficiente ( la cual a su vez se relaciona a tener buenos equipos, insumos y experiencia en la síntesis), como del proceso de purificación posterior a que el oligo sale del sintetizador. Por esa razón es que aplicamos la doble purificación (desalado y filtrado en gel) como estándar mínimo a nuestros oligos, para asegurar que usted recibe el oligo que solicitó y no un gran rendimiento de oligos “basura”.

Para el caso de sondas FRET u oligos marcados fluorescentemente, la purificación es importante tanto para asegurar que se cuenta con una mayoritaria población de oligos completos que reconocerán su cadena blanco eficientemente, como para retirar el fluoróforo que no se unió al DNA durante la síntesis, el cual aún libre, emite fluorescencia generando “ruido“ de fondo. Esa es la razón por la cual nuestras sondas FRET dan muy poca o nula emisión de fondo en ensayos de PCR tiempo real, porque son puros. Nos cercioramos de ello.

Opciones de purificación

Aún para los usuarios que rutinariamente solicitan oligonucleótidos, saber elegir el tipo de purificación depende de tres factores: el diseño del oligo o sonda, la aplicación que se tenga en mente, y las cuestiones técnicas alrededor de la síntesis. Tome en cuenta que los métodos más estrictos de purificación como lo es la realizada por HPLC, reducirán de manera significativa el rendimiento final del oligo o sonda; así mismo, los primers desalados proporcionan el mayor rendimiento pero con el menor porcentaje de pureza. Los oligos largos tendrán menor rendimiento que los cortos y podrán purificarse por un método u otro. Entonces, ¿cómo elegir la mejor purificación?

Vale la pena leer la información a continuación y si tiene dudas, por favor no dude en hacernos llegar sus dudas o bien solicitar a T4OLIGO se le asigne un especialista en purificación de ácidos nucleicos al siguiente correo: soporte@t4oligo.com

Las siguientes opciones de purificación de oligos y sondas están disponibles de manera rutinaria en T4Oligo :

Desalado y filtrado en gel (DFG).

Todos los primers de T4 oligo son, como mínimo nivel purificación DFG, es decir que han sido sometidos a un proceso de desalado y filtración en gel utilizando Sephadex, lo anterior tiene como objetivo remover compuestos residuales derivados de la síntesis, liberación y desprotección del oligo durante el proceso de producción, y en algunos casos, se eliminan algunos pequeños oligos truncos. Los primers con purificación DFG son ideales para secuencias menores a 40 bases que serán utilizados en aplicaciones como PCR punto final, qPCR, secuenciación y en algunos casos, técnicas de genotipificación como SNP´s y microsatélites.

¿Qué obtengo cuando ordeno un oligo DFG ?

Lo que debe esperar obtener cuando solicita un primer DFG, es un oligo sin restos de Hidróxido de amonio, sales, solventes etc; sin embargo, no se separan por completo los oligos completos de los truncos. Para un oligo de 20 bases por ejemplo, en promedio el 10% de los primers será trunco en una o más bases del extremo 5´, dicho porcentaje aumenta significativamente a partir de las 30 bases, hasta llegar a más de 25% para oligos de aproximadamente 70 bases.

¿Qué son los oligos truncos o incompletos?

Los oligonucleótidos truncos carecen de una o varias bases en el extremo 5´, por lo que, por ejemplo, cuando se agrega un sitio de restricción al oligo para posteriormente clonar el producto de PCR, es probable que se dé la amplificación, pero que no funcione la digestión del producto de PCR con la enzima de restricción correspondiente previo a la ligación, ello debido a que una proporción de oligos carece de ese sitio parcial o totalmente, y toda vez que para realizar una ligación el radio vector/inserto es crucial, es muy probable que una parte de sus insertos carezcan del extremo 5´integro (donde usualmente se localizan los sitios de restricción ) y por lo tanto no se generen los extremos cohesivos necesarios para una ligación exitosa.

Si se desea incrementar la pureza y obtener una mayor proporción de oligonucleótidos terminados respecto a los incompletos cuando se tiene en mente utilizarlos para aplicaciones sensibles, se recomiendan procedimientos más exhaustivos, como la purificación por cartucho o cromatografía de fase reversa (RPC), HPLC o PAGE. Para mayor información y sugerencias favor de referirse a las opciones de purificación a continuación, o escríbannos a soporte@t4oligo.com y solicite le sea asignado un asesor técnico especializado.

Purificación por cartucho o Cromatografía en Fase Reversa (RPC)

Para oligonucleótidos no modificados o sin marcas, T4 OLIGO recomienda purificación por cartucho o RPC, el cual provee hasta un 80% de pureza. Los oligonucleótidos purificados por RPC se sintetizan con el grupo DMT incluido en la última base del extremo 3´, y toda vez que sólo los oligonucleótidos completos pueden poseer dicho grupo DMT, ello permite la separación de oligos completos por afinidad del grupo DMT con la resina contenida en el cartucho, mientras que las secuencias truncas carentes de DMT son eliminadas. Posteriormente el oligo purificado es eluído del cartucho, el grupo DMT se remueve químicamente y se purifica por filtración en gel para eliminar residuos de Hidróxido de Amonio. Esta purificación es útil para aplicaciones como clonación, ligaciones, qPCR , fragmentos medianos para construcción de genes, entre otras.

¿Qué obtengo cuando ordeno un oligo RPC ?

Cuando se solicita ésta purificación debes esperar que sean removidos contaminantes como sales e impurezas producto de la síntesis química de los oligos, así como un 80% de primers truncos.

Es importante saber que a medida que la longitud del oligo se incrementa más allá de 80 bases la posibilidad de poseer grupos DMT transitorios en secuencias truncas se incrementa, por lo que se recomienda que para oligonucleótidos mayores a 85-90 bases se utilice otro método de purificación como HPLC o PAGE.

HPLC de Fase Reversa (RP-HPLC)

T4OLIGO utiliza HPLC de fase reversa para la síntesis de todas sus sondas marcadas ( FRET o TaqMan) a fin de eliminar cualquier contaminación de fluoróforos residuales, oligonucleótidos truncos y otras moléculas no deseadas resultantes durante la síntesis de sondas. Dichos contaminantes, de no ser removidos, elevarían la fluorescencia de fondo y opacarían la detección de la señal durante el desarrollo del PCR tiempo real. Los primers con alguna modificación como la adición de Biotina, Colesterol entre otros, o bien las sondas que posean fluoróforos y quenchers, como es el caso de las sondas FRET o TaqMan deben ser purificados por RP-HPLC para un óptimo desempeño, sin embargo, es importante hacer notar que para aplicaciones que involucren la interacción de la sonda u oligo con una célula viva ( como por ejemplo, PCR in vivo), se requiere una purificación posterior al RP-HPLC para remover solventes y sales residuales del proceso de purificación por RP-HPLC que pueden dañar, por ejemplo, al cultivo celular.

RP-HPLC normalmente permite obtener productos con una pureza de más del 90%. Aunque el principio de esta técnica de purificación es similar al que se utiliza mediante los cartuchos RPC, las resinas del RP-HPLC proveen mayor capacidad de retención de muestra, lo que se refleja en una mayor pureza y rendimiento, capacidad de purificación de fragmentos de hasta 200 bases, y remoción total de compuestos secundarios de síntesis.

HPLC Dual (AX/RP)

T4Oligo ofrece la purificación por HPLC de intercambio iónico seguido por HPLC de fase reversa, la que normalmente rinde productos con más de 90% de pureza, es el método adecuado cuando se requiere de procesos de purificación más estrictos, como son análisis de qPCR para aplicaciones industriales, sondas con combinaciones complejas de fluoróforos y quenchers, Molecular Beacons, Scorpion, etc.

Tips de purificación para sondas y oligos con degeneraciones

Las sondas con degeneraciones requieren sintetizar dos o más subespecies al unísono, es decir, que en una población de oligonucleótidos se agregue una u otra base de manera equimolar , por ejemplo si se desea un oligo con una degeneración A/T, en teoría 50% de la población de moléculas poseerán A y el restante 50% T en esa misma posición.

Para evitar distorsionar dicha equimolaridad, T4Oligo purifica las sondas marcadas que contienen degeneraciones usando únicamente RP-HPLC en vez de HPLC Dual (AX + RP), lo anterior se debe a que la purificación por AX- HPLC puede favorecer en una mezcla de oligos con una base de diferencia la purificación de un primer por encima del otro, lo que arruina la proporción equimolar y genera un sesgo en los resultados del PCR tiempo real. En cambio, la purificación por RP-HPLC purifica de manera uniforme las subespecies deseadas y no altera el resultado de un PCR donde se utilizan oligos degenerados.

¿Requiero pureza o rendimiento en mis oligos y sondas?

En síntesis de ácidos nucleicos, la pureza se refiere a dos factores: la cantidad de sales, solventes u otras moléculas presentes, y a la proporción de oligos o sondas completos que se tienen disponibles, es decir, a cuántos oligos son, de principio a fin, la secuencia que usted solicitó. La primera puede afectar la eficiencia de reacciones enzimáticas, la segunda la especficidad de nuestro ensayo.

Mientras que la escala de síntesis se refiere a el punto de partida para iniciar la síntesis de un ligo o sonda, el rendimiento final de un oligo se refiere a la cantidad que de hecho, recibimos en nuestro vial, dicho rendimiento es siempre variable, aún para secuencias iguales en una misma ronda de síntesis, pero más allá de eso, dependerá de la secuencia sintetizada y de factores variables como la reacción de síntesis química, la cual en la práctica nunca es idéntica; sin embargo, en T4Oligo establecemos parámetros de control de calidad que nos permiten que el rendimiento de un mismo oligo en dos síntesis distintas, no varíe significativamente.

Ahora bien, volviendo a la pregunta original, ¿requiero pureza o rendimiento?, depende completamente de su experimento, si el mismo exige que la mayor cantidad la población de primers sea completa y sin contaminantes, entonces usted requiere pureza y le recomendamos algunas de las opciones que T4oligo le ofrece. Pero si su experimento requiere un gran número de repeticiones, o bien una cantidad oligonucleótidos mayor entonces usted requiere un mayor rendimiento.

Si su experimento requiere tanto pureza como rendimiento, T4Oligo tiene la capacidad de hacerlo, por lo que en caso de requerir un mínimo de nmoles de rendimiento final y / o un grado de pureza específica, le pedimos especificarlo al momento de realizar su pedido para que un especialista le sea asignado, quién le sugerirá la escala de síntesis y purificación recomendada para sus necesidades. No dude en solicitar le sea asignado un especialista si requiere mayor información o asesoría: soporte@T4oligo.com

¿Por qué hay impurezas y productos truncos?

Durante el proceso de síntesis, las pirimidinas tienen mayor eficiencia de acoplamiento que otras, es así que cuando se tienen más de 3 purinas en tándem en una secuencia, el rendimiento final es menor, a la vez que se obtienen más oligos incompletos. Lo anterior nos lleva a inferir que si nuestro oligonucleótido tiene secuencias repetidas ricas en G o A, debemos ordenar una escala mayor y/o una purificación diferente a DFG. Así mismo, la longitud de un oligo influye en el rendimiento final y la pureza, es decir, a mayor longitud, mayor el número de oligos truncos y menor el número de nMoles recibidas.

 

Desempeño y calidad

¿Cómo aseguramos nuestra calidad?

Cualquiera que sea la aplicación para la que requiere utilizar oligonucleótidos, T4Oligo le ofrece la calidad y capacidad tecnológica que sus experimentos requieren, en tiempos de entrega sin comparación en México y sin pagar costos extra.

Con T4Oligo usted tiene la tranquilidad de recibir en su laboratorio sus oligonucleótidos en unos cuantos días, respaldados por un certificado de análisis y aseguramiento de la calidad que le da la certeza de que sus reactivos han sido cuidadosamente sintetizados bajo nuestra política y certificación en buenas prácticas de manufactura (GMP). Para conocer más sobre nuestras certificaciones y procesos de aseguramiento de la calidad por favor acceda al siguiete enlace:

control de calidad

 

 

Oligos Largos Extendameros

T4 oligo ofrece oligos extendameros son oligonucleótidos entre 75 y 200 bases, T4 oligo ofrece la síntesis especializada de estos oligos. Los extendameros son evaluados bajo estándares de calidad, además ofrecemos distintas opciones de purificación para asegurar que usted cuente únicamente con los oligonucleótidos de la longitud deseada para sus experimentos, ya sean para clonación, mutagénesis u otras aplicaciones demandantes.

Oligos modificados y especializados

T4Oligo le ofrece una variedad de modificaciones o marcas poco usuales o especializadas, por ejemplo:

  • Fosforilación en extremos 5’ y 3’. Esta modificación es ampliamente utilizada en procesos de mutagénesis directa.

  • Marcajes con Biotina. Esta modificación es útil en procesos que incluyan detecciones colorimétricas de ADN y capturas mediante el complejo biotina-estreptavidina.

Si tiene algún requerimiento especial de modificaciones o marcas, podemos atender sus solicitud. Por favor, sea tan amable de enviarnos un correo a soporte@t4oligo.com y le asignaremos un especialista a cargo de gestionar sus necesidades de oligos modificados.

Contamos con el equipo Biolytic 3900 con el cual podemos producir 48 oligos modificados por corrida, contamos con servicio de purificación por HPLC y control de calidad por espectrómetro de masas Sciex API 2000.

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